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　　内容简介

　　《宏基因组学：方法与步骤：原书第二版》共19章。详细介绍了以下内容：不同类型环境，包括海水环境、低温及碱性极端环境、植物内生环境等样本的DNA/RNA提取及宏基因组文库构建技术；从核酸、脱氧核酸、蛋白质三个角度分析环境微生物代谢活性；通过宏基因组测序获得功能基因分类及多样性的方法；从基因组学技术层面介绍复杂微生物群落的研究方法，以及挖掘活性基因（如有机物降解基因）及其表达的技术与工具；高通量地筛选活性酶基因如水解酶、纤维素酶、新型PHA代谢酶、磷酸酶、氢化酶、N-AHSL干扰酶等的方法；如何挖掘增加微生物次级代谢的信号。

　　目录

　　目录

　　前言

　　贡献者

　　第1章 构建小插入片段和大插入片段的宏基因组文库 1

　　1.1 介绍 1

　　1.2 实验材料 2

　　1.2.1 宏基因组DNA 2

　　1.2.2 小片段文库构建 2

　　1.2.3 大片段文库构建 3

　　1.3 实验方法 4

　　1.3.1 小片段宏基因组文库构建 4

　　1.3.2 大片段宏基因组文库构建 8

　　1.4 注释 10

　　参考文献 11

　　第2章 从海洋过滤样本提取总DNA与RNA及用于标记基因研究的cDNA通用模板的制备 13

　　2.1 介绍 13

　　2.2 实验材料 14

　　2.2.1 浮游细菌样品 14

　　2.2.2 DNA 与RNA同时提取 14

　　2.2.3 提取的DNA与RNA纯化 15

　　2.2.4 DNA消化和PCR对照 15

　　2.2.5 第一链和第二链合成 16

　　2.3 实验方法 16

　　2.3.1 从海水滤膜样品中同时提取DNA与RNA 16

　　2.3.2 纯化DNA与RNA 18

　　2.3.3 第一链和第二链合成 20

　　2.4 注释 20

　　参考文献 21

　　第3章 海洋宏基因组大片段文库的构建与筛选 22

　　3.1 介绍 22

　　3.2 实验材料 23

　　3.2.1 取样 23

　　3.2.2 宏基因组DNA的分离 24

　　3.2.3 16S rDNA系统发生分析 24

　　3.2.4 构建宏基因组大片段文库 25

　　3.2.5 从宏基因组文库筛选具有群体感应抑制活性的基因 25

　　3.3 实验方法 25

　　3.3.1 取样流程 25

　　3.3.2 宏基因组DNA分离 27

　　3.3.3 16S 扩增子测序 28

　　3.3.4 大片段文库构建 29

　　3.3.5 采用PCR扩增对宏基因组文库进行基于序列的筛选 31

　　3.3.6 基于功能的宏基因组文库筛选32

　　3.4 注释 35

　　参考文献 36

　　第4章 寒冷和碱性极端环境宏基因组文库的构建与筛选 40

　　4.1 介绍 40

　　4.2 实验材料 42

　　4.2.1 完整的细胞提取和DNA提取 42

　　4.2.2 文库构建 42

　　4.2.3 酶活性筛选 43

　　4.3 实验方法 43

　　4.3.1 从伊卡岩柱样品中获取DNA 43

　　4.3.2 文库构建 45

　　4.3.3 低温和高pH条件下酶活性的筛选 47

　　4.3.4 宏基因组的偏差评估及酶潜力的检测 49

　　4.4 注释 49

　　参考文献 50

　　第5章 基于DNA/RNA/蛋白质的稳定同位素探针技术用于活性微生物标志物的 高通量分析 52

　　5.1 介绍 53

　　5.2 实验材料 55

　　5.2.1 稳定同位素探针技术所需的试剂和设备 55

　　5.2.2 核酸纯化 56

　　5.2.3 DNA/RNA超速离心 56

　　5.2.4 16S rRNA基因测序 57

　　5.2.5 宏基因组/宏转录物组测序 57

　　5.2.6 蛋白质纯化的试剂和设备 57

　　5.2.7 蛋白质胶内消化 57

　　5.3 实验方法 58

　　5.3.1 被标记的土壤和沉积物样本的酸提取 58

　　5.3.2 通过氯化铯梯度离心分离同位素标记的DNA 59

　　5.3.3 通过CsTFA分离同位素标记的RNA 61

　　5.3.4 宏基因组和宏转录物组分析 62

　　5.3.5 提取已标记样本中的蛋白质 62

　　5.3.6 凝胶胰蛋白酶消化 63

　　5.3.7 利用高分辨率质谱分析同位素标记的蛋白质 64

　　5.4 注释 65

　　参考文献 66

　　第6章 植物内生细菌和真菌的多样性评估 68

　　6.1 介绍 68

　　6.2 实验材料 69

　　6.2.1 植物样本采集 69

　　6.2.2 处理植物材料 69

　　6.2.3 从粉末化的植物样本中提取DNA 70

　　6.2.4 标记基因扩增 70

　　6.2.5 测序数据的处理 71

　　6.3 实验方法 71

　　6.3.1 植物样本采集 71

　　6.3.2 处理植物材料 71

　　6.3.3 DNA 提取 72

　　6.3.4 标记基因的扩增和测序 72

　　6.3.5 测序数据的处理 74

　　6.4 注释 76

　　参考文献 77

　　第7章 通过宏基因组鸟枪法测序技术研究复杂微生物群落中的植物软腐病肠杆菌科病原菌 78

　　7.1 介绍 78

　　7.1.1 软腐病肠杆菌科 78

　　7.1.2 分泌系统 79

　　7.1.3 基因水平转移 79

　　7.1.4 宏基因组 80

　　7.2 实验材料 80

　　7.2.1 DNA提取 80

　　7.2.2 DNA富集 80

　　7.2.3 DNA文库制备 80

　　7.2.4 实验室设备 80

　　7.2.5 软件 81

　　7.3 实验方法 81

　　7.3.1 鸟枪法宏基因组测序 81

　　7.3.2 实验设计和采样 82

　　7.3.3 组装前的数据预处理 84

　　7.3.4 物种多样性分析 84

　　7.3.5 物种和功能注释 85

　　7.3.6 特定的注释工具 87

　　7.4 注释 88

　　7.5 总结 88

　　参考文献 89

　　第8章 来源于宏基因组的基因在变铅青链霉菌中的克隆、表达和发酵优化 92

　　8.1 介绍 92

　　8.2 变铅青链霉菌的转化 94

　　8.2.1 实验材料 94

　　8.2.2 实验方法 97

　　8.3 链霉菌载体及其特征 101

　　8.3.1 实验材料 107

　　8.3.2 实验方法 109

　　8.4 链霉菌中的基因表达调控元件 112

　　8.4.1 实验材料 114

　　8.4.2 实验方法 115

　　8.5 采用基于pAMR4系统的同源重组技术将由选用的启动子控制的目的基因整合到变铅青链霉菌染色体上 118

　　8.5.1 实验材料 119

　　8.5.2 实验方法 119

　　8.6 重组变铅青链霉菌的发酵 120

　　8.6.1 实验材料 120

　　8.6.2 实验方法 121

　　8.7 注释 124

　　参考文献 127

　　第9章 基于宏基因组数据的降解网络重建 132

　　9.1 介绍 132

　　9.2 实验材料 133

　　9.3 实验方法 133

　　9.3.1 宏基因组序列中分解代谢基因的鉴定 133

　　9.3.2 创建降解节点列表 134

　　9.3.3 设定网络的节点 136

　　9.3.4 添加节点和网络之间的连接 136

　　9.3.5 设置网络中节点的坐标 139

　　9.3.6 绘制降解网络 140

　　9.4 注释 142

　　参考文献 142

　　第10章 宏基因组DNA功能表达的新工具 144

　　10.1 介绍 144

　　10.2 实验材料 146

　　10.2.1 细菌菌株、培养基和抗生素 146

　　10.2.2 载体 148

　　10.2.3 感受态细胞的制备：溶液和试管 150

　　10.2.4 用于DNA提取和纯化的溶液 152

　　10.2.5 商业化试剂盒 153

　　10.2.6 酶 153

　　10.2.7 DNA梯状条带 154

　　10.2.8 设备和材料 154

　　10.3 实验方法 155

　　10.3.1 用穿梭载体pEBP18构建宏基因组文库 155

　　10.3.2 用TREX表达基因簇 161

　　10.3.3 颖壳伯克霍尔德菌的表达 165

　　10.3.4 荚膜红细菌的表达 168

　　10.4 注释 171

　　参考文献 174

　　第11章 基于微孔板的活性和立体选择性水解酶的筛选 178

　　11.1 介绍 178

　　11.2 实验材料 179

　　11.2.1 琼脂板活性实验（涂平板） 179

　　11.2.2 微孔板培养 179

　　11.2.3 细胞裂解 180

　　11.2.4 酶活性测定 180

　　11.3 实验方法 181

　　11.3.1 琼脂板活性测试 181

　　11.3.2 微孔板中酶的合成 181

　　11.3.3 微孔板中的细胞裂解 182

　　11.3.4 活性或手性选择性的筛选 182

　　11.4 注释 183

　　参考文献 184

　　第12章 基于宏基因组文库的纤维素酶的筛选 185

　　12.1 介绍 185

　　12.2 实验材料 187

　　12.2.1 无机盐培养基（MSM） 187

　　12.2.2 刚果红板检测 188

　　12.2.3 细胞粗萃取物的制备 188

　　12.2.4 DNSA检测 188

　　12.2.5 纤维素酶反应产物的薄层色谱分析 188

　　12.2.6 通过 HPLC 分析纤维素分解产物 189

　　12.3 实验方法 189

　　12.3.1 高纤维素分解微生物群落的富集 189

　　12.3.2 在刚果红平板上筛选纤维素酶阳性克隆 189

　　12.3.3 可能阳性克隆的再转化 190

　　12.3.4 具有纤维素分解活性克隆的细胞粗萃取物的制备 190

　　12.3.5 纤维素酶活性的分析 190

　　12.4 注释 194

　　参考文献 194

　　第13章 利用对硝基苯基底物筛选宏基因组文库中辅助性木质纤维素酶的 液相复用高通量筛选技术 197

　　13.1 介绍 197

　　13.2 实验材料 199

　　13.2.1 克隆文库培养与表达 199

　　13.2.2 对硝基苯基底物液相检测 199

　　13.3 实验方法 200

　　13.3.1 克隆文库的叠加复用 200

　　13.3.2 液相pNP检测 201

　　13.3.3 鉴定含有目标酶的克隆 202

　　13.4 注释 202

　　参考文献 204

　　第14章 修饰多酚类底物的糖基转移酶的筛选 206

　　14.1 介绍 206

　　14.2 实验材料 207

　　14.2.1 生物转化形成反应 207

　　14.2.2 利用薄层色谱对转化产物进行分析 208

　　14.3 实验方法 208

　　14.3.1 宏基因组克隆文库的生物转化反应 208

　　14.3.2 准备宏基因组样品以供TLC分析 209

　　14.3.3 生物转化产物的TLC分析 209

　　14.3.4 酶检测 210

　　14.4 注释 211

　　参考文献 212

　　第15章 从复杂微生物群落中分离编码新型PHA代谢酶基因的方法 213

　　15.1 介绍 213

　　15.2 实验材料 215

　　15.2.1 细菌生长培养基 215

　　15.2.2 分子生物学试剂 216

　　15.3 实验方法 216

　　15.3.1 细菌生长和储存条件 216

　　15.3.2 土壤宏基因组文库的构建 217

　　15.3.3 利用三亲本接合法将宏基因组文库转移到苜蓿中华根瘤菌和恶臭假单胞菌中 217

　　15.3.4 转移来自苜蓿中华根瘤菌或恶臭假单胞菌假定的互补克隆至大肠杆菌中 217

　　15.3.5 遗传分子生物学 218

　　15.3.6 PHA积累 218

　　15.3.7 PHA合成克隆宏基因组文库的筛选 219

　　15.3.8 利用营养缺陷从宏基因组文库中分离PHB循环基因 220

　　15.4 注释 221

　　参考文献 222

　　第16章 基于功能宏基因组文库的磷酸酶活性编码基因的筛选和异源表达 224

　　16.1 介绍 224

　　16.2 实验材料 225

　　16.2.1 基于功能宏基因组文库筛选鉴定磷酸酶基因 225

　　16.2.2 磷酸酶基因的异源表达 226

　　16.3 实验方法 227

　　16.3.1 通过基于功能宏基因组文库的筛选鉴定磷酸酶基因 227

　　16.3.2 磷酸酶基因的有效异源表达 229

　　16.4 注释 232

　　考文献 233

　　第17章 基于活性宏基因组文库的氢化酶筛选 235

　　17.1 介绍 235

　　17.2 实验材料 236

　　17.2.1 实验室仪器 236

　　17.2.2 菌株、质粒和生长培养基 236

　　17.2.3 试剂盒和（限制性内切）酶 237

　　17.3 实验方法 237

　　17.3.1 宏基因组文库构建及其与广泛宿主载体pRS44连接 238

　　17.3.2 宏基因组文库中吸氢活性基因的筛选 239

　　17.4 注释 242

　　参考文献 242

　　第18章 基于N-AHSL信号的干扰酶筛选 244

　　18.1

　　精彩书摘

　　第1章构建小插入片段和大插入片段的宏基因组文库

　　卡罗拉 西蒙（Carola Simon），罗尔夫 丹尼尔（Rolf Daniel）

　　摘要

　　地球上的生物多样性绝大部分隐藏在未被培养和鉴定的微生物基因组中。构建宏基因组文库这种不依赖微生物培养的方法可以用于发现这些尚未得到探索的遗传学宝藏。通过对来自不同环境的宏基因组文库进行基于功能或序列的筛查，人们发现、鉴定了大量新的生物催化剂。本章将介绍用环境DNA构建小片段宏基因组文库和以质粒和F黏粒作为载体构建大片段宏基因组文库的详细流程。

　　关键词

　　宏基因组DNA、小片段文库、大片段文库、质粒、F黏粒、全基因组扩增

　　1.1介绍

　　实践证明，使用从环境样本中直接提取的DNA构建宏基因组文库并加以筛查是一种可被用于发现有重要生物技术价值的新生物分子的强大工具[1，2]。从原理上看，宏基因组文库让我们可以获取一个生态环境中的所有基因信息[3，4]。构建宏基因组文库的一些步骤与对单一微生物的基因组DNA进行基因克隆的步骤相同，包括用限制性酶切或剪切将环境DNA打断成较小的片段，将它们插入适用的载体系统，以及将重组后的载体转入合适的宿主中，在大多数的研究中，这种构建宏基因组文库的宿主都是大肠杆菌[4]。

　　尽管构建宏基因组文库的概念很简单，但因为大多数宏基因组样本，如从土壤、沉积物中取得的样本生物类群规模庞大，构建良好覆盖宏基因组所必需的数量巨大的克隆则是一项巨大的技术挑战[4，5]。根据插入片段的平均长度不同，基因文库可以分为两种：构建在质粒中的小片段文库（长度小于10kb），构建在F黏粒、黏粒（长度可达40kb）和细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）（长度大于40kb）载体中的大片段文库。选择哪类载体系统用于文库构建取决于环境DNA的质量、期望的插入片段平均长度、所需的文库拷贝数、载体宿主和拟使用的筛查策略[3，5]。纯化后仍含有腐殖质或基质成分污染的环境DNA或在纯化过程中发生了降解、断裂的DNA只适用于构建小片段文库[3]。小片段宏基因组文库对于分离编码未知生物分子的单个基因和小型操纵子非常适用，而当鉴别由大基因簇编码的复杂通路，或鉴定决定未被培养微生物某些遗传特征的DNA大片段时采用大片段文库则是更合适的方法。在此，我们分别描述了一种构建小片段文库的方法和一种构建大片段F黏粒文库的方法。两种方法都被证明适用于克隆从多种环境样本中纯化出的DNA，包括从土壤、深海热泉、冰和人体中提取的样本[6-9]。

　　1.2实验材料

　　1.2.1宏基因组DNA

　　利用环境样本构建宏基因组文库和克隆功能基因依赖所提取DNA的质量，因为文库构建过程中的酶促反应对很多生物或非生物成分的污染都很敏感。尤其是构建大片段文库时必须使用高分子量环境DNA。文库构建需使用至少5～10μg经过纯化的环境DNA。

　　1.2.2小片段文库构建

　　1.Illustra GenomiPhi V2DNA扩增试剂盒[通用电气医疗集团（GEHealthcare），德国慕尼黑]。

　　2.phi29DNA聚合酶（10U/μL）和10×反应缓冲液[富酶泰斯生物技术公司（Fermentas），德国圣莱昂-罗特]。

　　3.S1核酸酶（100U/μL）和5×反应缓冲液（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。

　　4.DNA聚合酶Ⅰ（10U/μL）和10×反应缓冲液（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。

　　5.雾化器

　　[英杰公司（Invitrogen），德国卡尔斯鲁厄]。

　　6.打断缓冲液：

　　10mmol/LTris-HCl（pH7.5）、1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、10%（m/V）甘油，室温存储。

　　7.Biozym Plaque GeneticPure低熔点琼脂糖[百因美科学股份有限公司（Biozym Scientific GmbH），德国黑西施奥尔登多夫]。

　　8.50×TAE（三乙酸乙二胺四乙酸，Tris-acetate-ethylenediaminetetraacetic acid）缓冲液：242gTris-碱、57.1mL乙酸、100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加H2O至1L，室温存储。

　　9.GELase琼脂糖凝胶消化试剂盒（EPICENTRE生物技术公司，美国威斯康星州麦迪逊）。

　　10.3mol/L乙酸钠（pH5.0）。

　　11.5mol/LNH4OAc（pH7.0）。

　　12.T4DNA聚合酶（5U/μL）（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。

　　13.10mmol/LdNTP混合物（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。

　　14.克列诺（Klenow）片段（10U/μL）（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。

　　15.10×缓冲液O（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。

　　16.SureCleanPlus核酸纯化试剂盒（Bioline公司，德国卢肯瓦尔德）。

　　17.TaqDNA聚合酶和含(NH4)2SO4的10×反应缓冲液（Fermentas公司，德国圣莱昂-罗特）。

　　18.25mmol/LMgCl2。

　　19.100mmol/LdATP。

　　20.热敏磷酸酶和

　　10×反应缓冲液[纽英伦生物技术公司（New England Biolabs），美国马萨诸塞州伊普斯威奇]。

　　21.TOPO.XLPCR克隆试剂盒（Invitrogen公司，德国卡尔斯鲁厄）。

　　22.Bio-RadGenePulserII电转仪[伯乐公司（Bio-Rad），德国慕尼黑]。

　　23.卡那霉素母液：25mg/mLH2O，过滤灭菌并存储于–20℃。

　　24.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）母液：24mg/mL溶于H2O，过滤灭菌，每管2mL分装并存储于–20℃。

　　25.5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）母液：20mg/mL溶于N，N.-二甲基甲酰胺（DMF），过滤灭菌并存储于–20℃。

　　26.LB（lysogenybroth）固体培养基：10gNaCl、10g蛋白胨、5g酵母提取物，溶解于1L蒸馏水中，调节pH至7.2，再加入15g琼脂，高温灭菌。

　　27.含50μg/mL卡那霉素、48μg/mLIPTG和40μg/mLX-Gal的LB固体培养基：在500mL灭菌后尚未凝固的LB固体培养基中加入卡那霉素母液、IPTG母液和X-Gal母液各1mL。

　　1.2.3大片段文库构建

　　1.CopyControl.F黏粒文库构建试剂盒（EPICENTRE生物技术公司，美国威斯康星州麦迪逊），按生产商指示存储。

　　2.Biozym Plaque GeneticPure低熔点琼脂糖（Biozym Scientific股份有限公司，德国黑西施奥尔登多夫）。

　　3.Biometra Rotaphor脉冲场电泳仪（Biometra公司，德国哥廷根）。

　　4.5×TBE（Tris-硼酸-EDTA）缓冲液：54gTris-碱、27.5g硼酸、20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加H2O至1L，室温存储。

　　5.SureClean核酸纯化试剂盒（Bioline公司，德国卢肯瓦尔德）。

　　6.含10mmol/LMgSO4的LB培养基。

　　7.氯霉素母液：氯霉素按6.25mg/mL的浓度溶于乙醇，–20℃存储。

　　8.含12.5μg/mL氯霉素的LB固态培养基：在500mL灭菌后尚未凝固的LB固体培养基中加入1mL氯霉素母液。

　　9.3mol/L乙酸钠（pH7.0），室温存储。

　　10.噬菌体稀释缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH8.3）、100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2，室温存储。

　　1.3实验方法

　　文库构建由数个独立步骤组成。为了能够成功地克隆环境DNA，在不同步骤之间*好不要长期存储中间产物。如果无法避免，每个步骤完成后可将纯化后的DNA置于4℃存放几天。在开始进行质粒文库构建的DNA末端修复（参见1.3.1.5节）或F黏粒文库构建的片段长度分选（参见1.3.2.3节）之前，DNA可在–20℃存储。但是，在末端修复或片段长度分选之后，DNA不能在–20℃存储，因为反复冻融会损伤DNA链。另外，应该避免对样品DNA进行无必要的移液或吹打。只要试剂能够加入到DNA所在的容器中，就尽量不要移动DNA。当DNA必须要转移到新的离心管中时，使用大口径吸管或切掉枪头尖端以避免进一步打断DNA。

　　在完成每个步骤之后都要测量DNA浓度，以保证还有足够高的DNA浓度来完成后续步骤。因为DNA在各个步骤中会不断损失，在开始实验时*好使用足够多的DNA。在构建小片段文库时，如果可用的环境DNA总量小于5μg，可以先进行全基因组扩增（wholegenomeamplification，WGA）。可以用一种*近发表的方法[10]解开WGA时产生的超分支结构，从而提高克隆效率并避免异常的插入片段长度分布。

　　1.3.1.1节至

　　1.3.1.3节给出了一种对环境DNA进行WGA并解开产物超分支结构的方法。而当环境DNA的总量足够时，可以直接从1.3.1.4节开始构建宏基因组文库。

　　1.3.1小片段宏基因组文库构建

　　1.3.1.1环境DNA的全基因组扩增

　　1.按照试剂盒生产商给出的操作说明对环境DNA进行全基因组扩增，如使用Illustra GenomiPhiV2DNA扩增试剂盒[11]。

　　2.按照操作说明用

　　SureCleanPlus核酸纯化试剂盒纯化DNA[12]。干燥DNA沉淀的时间不要超过5～10min。

　　3.在30μLH2O中溶解DNA沉淀（见注释1）。

　　1.3.1.2解开超分支DNA结构（见注释2）

　　1.将下列组分加入一个灭菌离心管中：1.3.1.1节步骤3所述的经过扩增和纯化的DNA，5μL10mmol/LdNTP混合物，5μL10×phi29缓冲液，1μLphi29DNA聚合酶（10U/μL），加入H2O至总体积为50μL。这一反应混合液可以按照需要等比例放大。

　　2.30℃孵育2h。

　　3.65℃孵育3min使酶失活。

　　4.使用

　　SureCleanPlus核酸纯化试剂盒纯化DNA（参见1.3.1.1节步骤2和步骤3）。

　　1.3.1.3S1核酸酶处理（见注释2）

　　1.按以下比例建立反应体系：1.3.1.2节步骤4得到的全部产物，10μL5×S1核酸酶缓冲液，2μLS1核酸酶（100U/μL）。

　　2.37℃孵育30min。

　　3.使用

　　SureCleanPlus核酸纯化试剂盒纯化产物DNA（参见1.3.1.1节步骤2和步骤3）。

　　1.3.1.4打断宏基因组DNA

　　1.将1～2μL上一步得到的DNA在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。如果超过50%的DNA片段符合预期大小，则直接从1.3.1.5节开始操作。

　　2.按照操作说明组装雾化器。

　　3.将10～15μg环境DNA加至750μL打断缓冲液中，然后移液到雾化器瓶底（见注释3）。

　　4.拧紧雾化器的盖子并将其置于冰上，保持DNA处于低温状态。

　　5.将雾化器连接到压缩气源并用9～10psi①的气压打断10～15s，得到3～8kb长度的DNA片段。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，确定DNA已被充分打断且超过50%的DNA片段达到预期大小。可以通过调整打断气压或者打断时间来调整DNA片段的大小。

　　6.将DNA转移至两个无菌离心管中。

　　①1psi=6.89476×103Pa，全书同。

　　7.加入1/10体积的3mol/L乙酸钠（pH5.0）和2.5倍体积的96%乙醇沉淀DNA。轻柔混匀后将DNA置于冰上20min，之后用最高转速于4℃离心30min。

　　8.弃上清，并用70%冷乙醇清洗沉淀两次。第二次清洗后小心